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超分辨显微镜:成像革命

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尽管近年来取得了巨大的成就,但超分辨显微镜是一个相对年轻的领域,在这个领域存在许多缩写的混淆。然而,这使得迷人的时间,超分辨率显微镜打开了大门,以更广泛的成像应用。

玛丽自由体,贡献编辑,(电子邮件保护)

超限分辨光学显微镜2014年,诺贝尔奖授予了Eric Betzig、Stefan Hell和William Moerner。这是生命科学在过去十年中最重大的发展之一,而且它的发展还在继续。进展如此迅速和显著,一些观察家称之为“决议革命”。

多色、图像


Multicolor Stied Image - Vimentin,Alexa 647(红色的);alpha-tubulin, Alexa 594 (绿色);F-actin, Alexa 488 phalloidin (青色)。Confocal,DAPI(蓝色的)。Eugene Katrukha/乌得勒支大学提供。

生物医学应用的需求非常广泛——从需要高时空分辨率、长采集时间、三维成像、深层组织/体内成像等。利用聚焦光的远场光学显微镜是一个重要的工具,特别是在研究活细胞和生物体。不幸的是,光学显微镜受到了限制;光的衍射限制了图像的空间分辨率。

这意味着,细胞蛋白质分布的细节,例如,只能在一定程度上可视化。幸运的是,近年来已经见证了超分辨率远场光学显微镜(纳米)技术的发展,如STED, GSDIM, RESOLFT, PALM, STORM, SIM或SSIM,以及FINCH/CINCH(见文章结尾的缩略词定义),所有这些都以某种方式解决了远场光学显微镜有限的空间分辨率问题。

使用3D-STORM成像的部分细胞的肌动蛋白细胞骨架。


使用3D-STORM成像的部分细胞的肌动蛋白细胞骨架。投影图像已经用颜色标注了深度。肌动蛋白的细胞骨架用染料标记,小的非抗体结合蛋白,特定于肌动蛋白。由Ruth Hughes/Alistair Curd/利兹大学提供。



与传统光学显微镜相比,SIM在空间分辨率上实现了令人难以置信的两倍提高,但STED、RESOLFT、PALM/STORM和SSIM走得更远,将光学图像分辨率的极限推向了纳米尺度。因此,所有的超分辨率技术开辟了生物医学研究的新途径。

“原则上,任何这些技术都可以应用于任何样本,以提供”超级溶解“形象,”英格兰大学Astbury中心的米歇尔·佩克姆教授说。“在实践中,个人选择将包括可用于图像选择蛋白质的染料,探针,抗体或荧光蛋白标签的可用性,以及设备可用性和易用性。”

SIM:虽然复杂,但这是一个很好的妥协

“SIM应用了结构照明,比传统显微镜提高了两倍不需要像STED/RESOLFT和PALM/STORM那样的光开关或闪烁,”牛津大学医学研究委员会人类免疫单元沃尔夫森成像中心的首席研究员和科学主任克里斯蒂安·埃格林教授说。他是德国耶拿弗里德里希-席勒大学和莱布尼茨光子技术研究所的超分辨率显微学教授。国际买球的网站“因此,SIM可以应用于传统样本,固定或活细胞,甚至3D。”

对于许多生物成像应用,两个因子足够好,使SIM在空间分辨率和长时间之间的良好折衷。但有缺点。

“作为风暴/手掌,需要繁琐的数据分析,这是许多人的黑匣子。只有几个代码可用,“Eggeling说。“因此,数据分析可能易于伪影。人们正在尝试改进这一点,生成控制软件来检查伪像 - 例如SIM-CHECK。“

Alistair Curd是利兹大学阿斯特伯里中心研究3D STORM/PALM装置的Peckham小组的研究人员。
Alistair Curd是利兹大学阿斯特伯里中心研究3D STORM/PALM装置的Peckham小组的研究人员。Mark Bickerdike/利兹大学提供。

另一个缺点是,每一个最终图像都需要记录多个图像,这延长了总的采集时间,从而降低了时间分辨率,特别是3D记录。尽管如此,SIM的记录时间已经稳步提高,越来越多的相关技术,如扫描或airy扫描显微镜正在出现。一种超分辨率的全息方法,FINCH现在可以在一个瞬间创建超分辨率的图像。一般来说,SIM和相关技术是一个很好的折衷和可能是最好的技术核/染色体成像。

你看到什么就会得到什么

与SIM不同,STED提供的是不需要数据分析的直接图像。STED不仅简单,而且用途广泛,适用于固定细胞和活细胞。原则上,这利用了典型的标记染料用于共聚焦/宽视野显微镜。在实际应用中,通常使用的是特定于sted的染料。

eGFP-EB1在活细胞中的图像,使用iSIM显微镜收集。
eGFP-EB1在活细胞中的图像,使用iSIM显微镜收集。这是延时序列的概要图像,其中EGFP-EB1的顺序位置是颜色编码的(表示随时间的位置变化)。礼貌的露丝休斯/ alistair凝乳/达伦汤姆林森/安娜洛帕塔/基督徒Tiede / Michelle Peckham。

“STED技术使得具有纳米级分辨率的亚细胞结构的光学成像。多光子激发荧光成像提供了内在光学切片,有限的光漂白和光毒性,以及更深入的渗透,散射组织成像的所有关键优势,“Spectra-Mathics产品营销高级经理Julien Klein表示。

spectrum - physics提供了超快激光器,使混合STED显微镜能够将超分辨率和多光子激发(MPE)荧光的优点结合在一起。

研究员Alexa Cleasby。
研究员Alexa Cleasby是维康基金会issf资助的研究员,检查由利兹大学阿斯特伯里中心Peckham小组建造的iSIM超分辨率显微镜的光学对准。Mark Bickerdike/利兹大学提供。

Klein说:“在一个特定的方案中,通过结合飞秒红外1-µm激光器(如spectral - physics的HighQ-2)用于双光子激发和可见连续波激光器用于耗尽,可以同时获得STED和MPE成像的优势。”

STED的一个独特特点是,空间分辨率可以根据增加的STED激光器的强度进行调整——无论是在2D还是3D,从共聚焦到原则上的无限尺度。这为图像采集提供了更大的灵活性。

“例如,如果样本不是太亮或样品制备不是太准确,就可能牺牲空间分辨率来获得更好的信噪比,”Eggeling说。“另一方面,空间分辨率的调整允许独特的应用,如STED-FCS [荧光相关光谱以前所未有的细节揭示分子的扩散模式。”

在Jurkat t细胞中F-actin (Lifeact-Citrine)的共聚焦和STED显微镜图像。这些数据是由Mathias Clausen和Marco Fritzsche收集的。
在Jurkat t细胞中F-actin (Lifeact-Citrine)的共聚焦和STED显微镜图像。这些数据是由Mathias Clausen和Marco Fritzsche收集的。由牛津大学Weatherall分子医学研究所提供。

由于所涉及的高激光强度,在标签的光漂白和细胞活力方面,STED显微镜通常被认为是非常光毒性的。然而,越来越多的活细胞应用表明,如果在获取模式、标记协议和样品制备方面注意的话,STED显微镜是观察具有高空间和时间分辨率的细胞动力学的合适工具。

超快激光器也可用于多种方案,如创建一个双光子激励脉冲序列或高重复频率啁啾耗尽光束。例如,近红外激光器,如光谱物理的迈泰,可以通过玻璃棒和/或光纤将脉冲持续时间拉伸到数百皮秒,从而产生高重复频率的脉冲耗尽光束用于STED。

通过HyVolution 2获得COS-7细胞。
通过HyVolution 2获得COS-7细胞。由Jana Doehner/苏黎世大学显微和图像分析中心提供。

徕卡微系统公司的Rolf Borlinghaus将STED描述为研究含有真实三维空间的厚样本的最佳方法。借助超分辨率技术闪电和徕卡TCS SP8 STED纳米镜,徕卡微系统旨在帮助神经生物学、癌症研究和免疫学的科学家可视化分子相互作用和活细胞的结构,以了解生命的真正本质。

最后,Abberior正在开发一种新的STED仪器,包括用于广角显微镜的STED附件(STEDYCON),以及承诺分辨率高达1纳米的前沿方法MINIFLUX。

PALM/STORM/GSDIM:最流行的技术

这些是不同的首字母缩写,但每种方法都指向相同的基本原则。它们的普及是由于一个相对简单和成本效益的设置,因为通常一个正常的全内反射荧光(TIRF)/宽视场显微镜就足够了。在普通实验中,它通常也能达到最高的空间分辨率,标记可以用传统的染料和特殊的缓冲液来使它们闪烁,或者用特殊的光激活或光可切换的荧光团来完成。

2006年首次报道的PALM/STORM/GSDIM利用光诱导荧光开关对单分子的空间重叠图像进行时间分离。这样就可以高精度地确定它们的位置,并从这些分子位置重建具有亚衍射极限分辨率的图像。

“因此,PALM/STORM/GSDIM的分辨率不受衍射的限制,而是受可以测量分子位置的精度的限制,在某些情况下,还受局部分子密度的限制,”Eggeling说。

缺点包括相当繁琐的数据分析,用户必须输入阈值,这将引入伪影/偏差;为了获得最终的超分辨率图像,需要记录成百上千个单独的摄像机图像——即,图像获取是相当长的时间,因此很难观察到更快的活细胞动态;由于单个孤立分子需要开启、关闭和定位,因此需要低背景噪声,因此TIRF仍然是首选的采集模式。然而,新的软件方法有助于减少潜在的工件。

尽管如此,这项技术仍在稳步改进,特别是在自动化、无偏见的数据分析、速度和深度样本成像(例如,通过使用光片)方面。最近一种被称为MINIFLUX的方法——通过使用来自STED方法的特征来提高定位精度,从而要求更低的光子数——将开辟新的途径,Eggeling说。

RESOLFT:温和的照明有利于活细胞成像

RESOLFT应用与STED相同的原理,但它也使用特别的可逆、可切换的荧光标签,如PALM。由于使用了这些标签,超分辨率可以在比标准激光器低得多的激光强度下实现。温和的光照允许在纳米尺度上长期记录神经元蛋白及其在细胞和组织中的动态。

“不幸的是,到目前为止,可逆可切换荧光标签的有限可用性阻碍了通用适用性,”Eggeling说。“但这些都在不断改进,变得更加可行。”

SSIM:有限的应用程序

SSIM在SIM上使用可逆光开关,以实现空间分辨率的改善,优于两倍的因素。但问题与SIM和RESOLFT是一样的——除了原理证明之外,适用性仍然非常有限。

CSREM或CLEM:电子显微镜和光学显微镜的结合CSREM或CLEM结合了电子显微镜和其他超分辨率技术,通常是STORM或PALM。它只能应用于固定的样品和标记来识别特定的样品区域,可以用金珠子或盖玻璃上的标记。

利兹大学的佩卡姆说:[技术]“这可能是有用的在活细胞——利用超限分辨成像检查一个特定的行为与高分辨率的蛋白质,随后快速固定(例如,通过高压冷冻)和电子显微镜成像研究蛋白质在细胞超微结构的背景下。”

今天和明天的照片

现在,越来越多的实验室经常使用STED、RESOLFT、PALM和STORM来探测成像光波长的一小部分长度范围内的透明物质。这些技术的一些应用产生了关于膜纳米结构和神经科学的信息,以及与阿尔茨海默病和亨廷顿病相关的蛋白质聚集机制的研究。

但是,获得更多空间分辨率的代价 - 准确的样品准备和优化的标签变得至关重要。特别地,大尺寸的常规抗体开始变得限制,更多的人使用纳米甲基(或人工结合蛋白,例如与较小的合作蛋白。

“一般来说,具有超级化学显微镜,需要轻松制备样品。在共聚焦/宽场显微镜下,可能符合高背景或不正确的固定等不正当的标记,但是将显着恶化超级化图像,“Eppeling表示。“类似地,如果细胞不满意,与传统的共焦/宽场显微镜图像相比,它们通常会在超级化图像中较快死亡。”

有一些技术试图在提高空间分辨率和设置或分析的复杂性之间提供折衷。多家公司提供的Airy-scan或iSIM显微技术都类似于SIM,在传统的共聚焦或广角显微镜基础上稍加改进,即可实现高达1.7倍的空间分辨率。另一方面,有机化学家不断努力提高荧光标记的光子产率是进一步改进的基础。

一个瞥见的iSIM,展示了复杂的光学光路径。

一个瞥见的iSIM,展示了复杂的光学光路径。Mark Bickerdike/利兹大学提供。

芬奇/CINCH(菲涅耳非相干相关全息术)显微术是一种新的、更简单、更便宜的方法。自从它在马里兰州罗克维尔的CellOptic公司发明以来,它已经由CellOptic的首席执行官Gary Brooker博士开发了十多年。他们与该公司的尼森·西格尔博士合作,发明了一种名为CINCH的共聚焦显微镜,单次曝光就能产生100纳米分辨率的共聚焦超分辨率图像。全固态结构很容易适应现有的显微镜。

芬奇是第一个也是最简单的非相干全息术。现在,用一个单双折射透镜,芬奇用一个物体发出非相干光,通过物体发出的两个球面波之间的自干涉,在单光束单snap系统中产生全息图。从物体中任何一点发出的光被分成两束差分相位调制的光束,然后在同一个平面上重新组合,产生干涉条纹。一份发表于自然光子学(doi: 10.1038 / nphoton.2016.207)强调了FINCH显微镜快速产生多色超分辨生物图像的能力。

“FINCH从其他超分辨率方法中脱颖而出,因为它简单易用,只需要一个专门的成像透镜和快速计算,而不需要广泛的照明策略,非常大的数据集,或有限的染色选项,”Brooker说。FINCH可以提供类似SIM的分辨率,其速度几乎可以实现任何微观应用的活细胞成像。”根据2015年超分辨率显微镜路线图,由物理研究所发表在其物理学报D:应用物理(0022 - 3727/48/44/443001 doi: 10.1088 /),下一步的发展将是将超分辨显微镜的应用扩展到更广泛的科学问题。从某种意义上说,这意味着该显微镜应该能够处理更广泛的样本。

该路线图由该领域一些最著名的人合著,包括Stefan Hell和Eggeling,强调使用自适应光学访问较厚的样本将允许在组织应用中更多地使用超分辨率,在发育生物学、神经科学和其他领域有显著的潜在好处。

自适应光学广泛使用的另一个好处是,超分辨率的可用性将得到提高,因为它提供了系统的自校准和自动对准的机会,从而减少了内部技术支持的需要。诸如此类的进展将把这些方法转变为普通的实验室工具。


解读与超分辨率显微镜有关的首字母缩写

超级化学显微镜是用于几种超出衍射极限的技术的伞长术语,其中大部分是纳米级。一些例子包括:

•SIM卡:结构化照明显微镜

•发生:受激发射耗尽显微镜

•棕/暴雨/ GSDIM:光活化定位显微镜/随机光学重建显微镜/基态耗尽显微镜,然后单个分子返回

•RESOLFT:可逆可饱和光学线性荧光转换

•SSIM:饱和结构照明显微术

•CSREM / CLEM:相关超分辨光学和电子显微镜/相关光学和电子显微镜

•芬奇/有把握的事情:菲涅耳非相干相关全息术。CINCH是共焦版本。


EuroPhotonics
2017年春季
术语表
荧光相关光谱
一种强大的方法,称为FCS,用于确定溶液或膜中荧光分子的平均扩散系数。FCS测量依赖于通过焦卷体积记录数千分子的转变。短测量时间以及观察点的自由定位或扫描的组合使FCS成为研究扩散异质性随时间和空间的优异工具。
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