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智能探针捕获生物标志物序列

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具有茎环结构的荧光标记的核酸仪器有助于鉴定特异性癌细胞序列。

苏莱曼A. Oladepo,法赫德国王石油和矿物大学

智能探针是发夹寡核苷酸,基本上是一系列核酸,标有一个荧光团一端并在另一端与连续的鸟氨酸残留物束缚1。具有适当吸收的外部染料标签通常用于荧光猝灭,这是反应的信号。但最近的研究表明,鸟苷的氧化电位较低,可以对普通荧光染料进行有效的荧光猝灭2。因此,鸟苷用作智能探针中的猝灭剂,其可以检测癌症和其他条件的生物标志物。

由Istock.com/mkarco提供。


由Istock.com/mkarco提供。

在过去的研究中已经用于MicroRNA的几种检测方法。这些包括聚合酶链反应,Northern印迹,原位杂交和微阵列方法。虽然这些传统方法仍在使用中,但它们存在某些挑战,使其继续采用的持续收养量不那么吸引人。

例如,聚合酶链反应方法的选择性和特异性未有问题;然而,检测过程需要很长时间,因为它需要纯化的分离的RNA,并且该过程非常涉及。Northern印迹是半定量和麻烦的,它具有低灵敏度并且需要大量的样品。微阵列方法的高通量能力,它们呈现了有限的灵敏度,选择性和特异性。

这些局限导致了MicroRNA检测的新和新兴方法的开发。这些方法包括电化学和比色方法和核酸扩增,以及这里呈现的智能探针,混合和读均匀的方法。

智能探测器组成

智能探头主要设计成具有在室温下保持的茎环结构(图1)。探针的环路序列与目标兴趣序列完全互补 - 研究或生物医学检查的主题 - 而茎绞线是自互补的,并且通过氢键密切合在一起。因此,在室温和不存在靶​​序列的情况下,探针保持其发夹,茎环构象。该构象将荧光团和猝灭剂紧密地放置,因此荧光信号被有效地降低。

图1.示出其茎环构象中的智能探针的示意图,以及其不同温度的各种构象。在不同构象下,荧光信号的温度分布也显示出来。由法赫德国王石油与矿产大学提供。


图1所示。图中显示了智能探针的茎环构象,以及在不同温度下的不同构象。在不同构象下,荧光信号的温度分布也显示出来。由法赫德国王石油与矿产大学提供。

智能探针的杆关闭,荧光团和猝灭剂彼此略微重叠。该构象被称为探针的OFF状态。然而,当存在靶序列时,探针在经历荧光团和鸟苷猝灭剂的构象变化时与目标自发地杂交。这种双链体形成产生强烈的荧光信号,因为猝灭剂现在远离荧光团,因此不能终止荧光信号(在状态下)。

如果靶具有单碱基错匹配(图2),通常与突变相关联,使得序列与探针的环路不完全互补,因此由于探针与不匹配序列之间的非特异性相互作用也会发生自发杂交。并且双工稳定,这导致荧光信号小于用记录最大荧光的完美目标产生的荧光信号。信号电平的这种差异表明,智能探针能够在完美的目标和不匹配序列之间巧妙地区分。探头在检测到完美目标序列的低水平方面也非常敏感。事实上,这种发夹探针的受约束结构对其固有的灵敏度负责3.。由于探针被标记上荧光染料,由此产生的荧光信号由荧光光谱仪测量。

图2。发夹式智能探头,当阀杆关闭,荧光团和淬灭器接近(关闭状态)时。该智能探针可以形成一个稳定的双工与完美的目标序列,从而产生高荧光信号。它也可以与含有单碱基失配的失配目标形成不太稳定的双工,因此产生的信号更少,这取决于期望的效果。由法赫德国王石油与矿产大学提供。


图2。发夹式智能探头,当阀杆关闭,荧光团和淬灭器接近(关闭状态)时。该智能探针可以形成一个稳定的双工与完美的目标序列,从而产生高荧光信号。它也可以与含有单碱基失配的失配目标形成不太稳定的双工,因此产生的信号更少,这取决于期望的效果。由法赫德国王石油与矿产大学提供。

如果温度逐渐增加室温,则智能探针的杆开始熔化,并且荧光团猝灭剂对开始分离,并且它们彼此远离。随着温度升高,可以通过记录的荧光信号跟踪这种逐渐构象变化。因此,在室温下,当荧光团和猝灭剂彼此重叠时,杆关闭,并且由于鸟苷残基淬火而仅有有限的荧光信号(图1)。

随着温度的逐渐升高,茎融化,荧光信号逐渐开始增加。随着温度的升高,信号继续增加,直到茎完全打开,荧光团猝灭剂对最大程度地分离。这种最大的分离对应着最大的荧光信号。

低电平和最大信号之间的拐点区域的中点代表了智能探针杆的熔化温度。如果温度进一步增加,则探针转变为随机线圈构象,其中荧光团和猝灭剂的相对位置是随机的。因此,荧光信号开始降低,因为荧光团和猝灭剂主要彼此更靠近。由温度依赖性荧光信号遍历的整个轮廓与发夹探针的预期的乙状曲线曲线一致4.。该剖面可称为热转变剖面或热变性剖面。

在智能探针(SP) - 特性混合物上进行的温度依赖性荧光测量产生热过渡轮廓,其与单独的探针产生的热过渡轮廓不同。如果存在完美的目标,则探针随目标自发地杂交,并且构象变化,使得形成双链体,因此强制荧光团和猝灭剂。荧光与变化的温度增强了这一结果(图3)。

图3。智能探针和它与一个完美目标的杂交形成一个稳定的双工荧光信号(右)。智能探针及其与不匹配靶标杂交形成不太稳定的双工,导致荧光信号略低(左图)。由法赫德国王石油与矿产大学提供。


图3。智能探针及其与完美靶标杂交形成稳定的荧光信号(正确的)。智能探针及其与不匹配目标的杂交形成稳定的双链体,导致荧光信号略低(剩下)。由法赫德国王石油与矿产大学提供。

因此,在室温下,容易地形成稳定的双链体并产生强烈的荧光信号。如果温度增加,则双相将逐渐熔化,荧光信号逐渐减小。当温度升高时,信号的降低继续,直到双工完全熔化,并且探针完全从目标上脱离并形成发夹。由于探针的茎的熔化,如果超出该点的温度升高,则荧光信号可能再次略微上升。如果目标包含一个基本不匹配,则探针还通过非特异性相互作用与不匹配目标形成双工。发生这种情况是因为整个基本序列与完美目标的相同,除了一个单个基础不同,如下面的示例所示:

然而,由于单碱基错配,双工将略微稳定,因此该双工产生的信号电平略小于完美目标的双工产生的信号。因此,两种双工之间的信号电平的差异对应于完美目标是否涉及双工形成。它还用于表明智能探针能够通过报告略微不同的荧光信号水平来区分两种相似的序列。

智能探针目标

智能探针可用于序列特异性检测各种靶标,例如MicroRNA(miRNA)和其他核酸靶标。这里描述的特定探针是由石油公司国王石油大学的研究人员使用的探针,矿物质序列的合成miR-21,癌症生物标志物。因此,这种合成miR-21序列是工作中使用的完美目标序列。为了准备研究,将由pH7.5和钠和镁离子的Te(Tris-EDTA)缓冲液组成的智能探针的100纳摩尔溶液与3×过量的完美靶,并在黑暗中温育〜5H。

然后通过爱丁堡仪器对FLS920荧光光谱仪进行荧光信号的温度依赖性测量。使用热电冷却样品支架,通过来自Quantum Northwest Inc的TC 125温度控制单元实现实时温度控制,以确定智能探针可以序列 - 专门识别目标并区分其和类似的用单碱基错配的序列,在智能探针的100纳米摩尔溶液中也将3×过量的错配靶序列混合,并且在测量荧光之前在黑暗中类似地温育〜5小时。探针中使用的荧光团是6-羧基荧光素(6-FAM)。激发和发射波长分别为490和520nm,发射扫描从500到650nm获得。所有数据分析都使用最大〜520nm的发射。

测量智能探针,SP-目标双工和SP-Mismatch双层的温度依赖性荧光信号,并使用分析的数据来产生热转换轮廓。当茎完全拆卸时,按预期执行探针,在低温下在低温下产生低信号,在高温下产生高信号。

对于SP-靶双链体,荧光信号在室温下高,因为探针能够序列 - 特异性地识别该靶标,与其杂交,并使茎完全分离并产生观察到的高荧光信号并产生观察到的高荧光信号。由于温度逐渐熔化并且荧光团和猝灭剂逐渐彼此逐渐接近,信号随着温度的增加而降低。

为SP-Mismatch双链体记录类似的轮廓,尽管室温产生较低的荧光信号。在室温下,为Mismatch双工记录的荧光信号约为SP-Target双工的80%。相对低的荧光信号意味着由于在不匹配序列中存在的单碱基错配的结果,SP-Mismatch双工不太稳定。相对低信号报告这种降低的稳定性。信号差异表示智能探针能够在完美的目标和不匹配序列之间巧妙地区分。

智能探针的熔化温度为63°C。对于SP目标双工,它是47°C,而对于SP-Mismatch双工,它被发现为37°C。熔融温度值之间的宽间隙进一步表明探针能够区分完美和不匹配的靶序列。它还证明了智能探针符合其熔化温度比双相高出5°C时的设计要求,使得即使在双工完全融化之后,智能探头也必须保持发夹5.

虽然在室温下由智能探针产生的微妙鉴别是可接受的,但可以在〜52℃下获得更好的辨别。尽管由SP目标双工记录的信号低于在室温下记录的信号,但是智能探头和SP-Mismatch双面则在52℃下具有基本上等于信号电平。这表明探针可以在该温度下呈现出色的辨别,因为SP-Mismatch双工产生的信号是由智能探针产生的背景信号。因此,在通常孵育过程之后,在该温度下测量荧光信号。

在52°C时,sp -目标双工所产生的荧光信号远高于智能探针和sp -失配双工所产生的荧光信号。因此,这里描述的智能探针可以很好地区分完美目标和错配序列,尽管这两个序列非常相似。

这项工作中使用的目标寡核苷酸是模拟miR-21癌症生物标志物的合成核酸。该工作为将基于智能探针的同质miRNA检测方法应用于肿瘤细胞系等真实样本中检测miR-21奠定了坚实的基础。目前,法赫德国王石油与矿产大学正在进行使用这种基于智能探针的方法进行体内miR-21检测的实验室实验。

遇见作者

Sulayman A. Oladepo是沙特阿拉伯国王石油公司石油公司大学化学系助理教授。他目前的研究兴趣位于癌症检测,生物分析方法开发和光谱仪表的智能分子探针的发展。在加入KFU​​PM之前,Oladepo致力于涉及用于制药的药物可吸入粉末的低频转换拉曼仪器的项目;电子邮件:(电子邮件保护)

参考

1. J.P. knemeyer等。(2000)。用于检测单分子水平特异性DNA序列的探针。肛门化学,第72卷,第3717-3724页。

2.C.A.M. Seidel等人(1996)。荧光染料的碱基特异性猝灭。1.碱基单电子氧化还原电位及其与静态和动态猝灭效率的关系。J理论物理化学,卷。100,pp。5541-5553。

3. G. Bonnet等人。(1999)。热力学基础的结构化DNA探针的增强特异性。Proc Natl Acad Sci USA,卷。96,pp。6171-6176。

4.S. Tyagi和F.R. Kramer(1996)。分子信标:杂交时发出荧光的探针。NAT BIOTECHNOL.,卷。14,pp。303-308。

5. S.A. Oladepo(2018)。MIR-21体外检测单标记荧光智能探针的设计与表征。: Spectrosc,第72卷,第1期,79-88页www.doi.org/10.1177/0003702817736527.

BioPhotonics
5月/ 6月2021
词汇表
荧光团
发出荧光的材料。
智能探针 荧光团 猝灭剂 鸟嘌呤核苷 完美的目标序列 不匹配目标序列 法赫德国王石油与矿产大学 特性

注释
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